sop微生物檢查操作規(guī)程
| |頒發(fā)部門 | | |微生物限度檢查操作規(guī)程 |接收部門 | | | |生效日期 | | |操作標(biāo)準(zhǔn)---質(zhì)量 |制定人 | |制定日期 | | |文件編號| |審核人 | |審核日期 | | |文件頁數(shù)|共6頁 |批準(zhǔn)人 | |批準(zhǔn)日期 | | |分發(fā)部門| | 1目的 建立微生物限度檢查的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 2 范圍 適用于本廠質(zhì)監(jiān)科化驗(yàn)室對本廠生產(chǎn)的固體制劑及物料進(jìn)行微生物限度的 檢查。 3 責(zé)任 化驗(yàn)員有責(zé)任按照本操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)、判定,并對檢驗(yàn)結(jié)果負(fù)責(zé)。 4 定義 微生物限度檢查法系指非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染程度 的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。 5 內(nèi)容 5.1 總則： 5.1.1 供試品應(yīng)隨機(jī)抽樣。一般抽樣量為檢驗(yàn)用量（2個以上最小包裝單位）的3倍量。 5.1.2 供試品在檢查前不得開啟，檢查全過程均應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，嚴(yán)防再污染。 5.1.3 控制菌的污染檢查應(yīng)做相應(yīng)的已知菌對照試驗(yàn)，對照菌株為大腸桿菌[CMCC（B）44 102]，每批試驗(yàn)已知菌加入量為50-100個。 5.1.4 染菌量的檢查或控制菌的檢查均應(yīng)做空白對照試驗(yàn)。 5.1.5 供試品稀釋成稀釋液后應(yīng)在均勻狀態(tài)下取樣，凡有抑菌成份或防腐劑的供試品應(yīng)做 特殊處理后進(jìn)行檢驗(yàn)。 5.1.6 供試品稀釋后應(yīng)在1小時內(nèi)操作完畢。 第2頁/共6頁 5.1.7 除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)溫度為30-35℃，霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為25- 28℃，控制菌培養(yǎng)溫度為36℃±1℃。 5.1.8細(xì)菌、霉菌檢驗(yàn)結(jié)果的報告以1g、1ml或10cm2為單位；控制菌檢驗(yàn)報告以每1g、每 1ml或每10cm2為單位報告“檢出”或“未檢出”。 5.2儀器、用具 恒溫培養(yǎng)箱、隔水式生化培養(yǎng)箱、電子天平，移液管(1ml、10ml)、試管、離心管、雙碟 、鑷子、剪刀、不銹鋼吸管筒、酒精燈、取樣勺、稱量紙、研缽一個、不銹鋼雙碟筒。 5.2.1用具的包扎 移液管：用紗布包住移液管，然后放入不銹鋼滅菌筒內(nèi)。 試管、雙碟：試管在管口塞上紗布棉塞、雙碟放入不銹鋼雙碟筒內(nèi)。 無菌衣、褲、帽、口罩：用布口袋將洗凈的衣褲、帽子、口罩配套后裝入，扎緊袋口， 再用牛皮紙包好。 5.2.2用具的滅菌 將包扎好的用具，在121±0.5 ℃蒸汽滅菌柜中滅菌30 分鐘，物品取出時切勿立即置冷處，以免急速冷卻滅菌物品內(nèi)蒸汽凝造成負(fù)壓，易致染 菌，應(yīng)置烘箱烘干。 5.3培養(yǎng)基、試劑 5.3.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 稱取本品36克，加1升蒸餾水，加熱溶解后，按需要進(jìn)行分裝，經(jīng)121℃15分鐘滅菌備用。 5.3.2虎紅培養(yǎng)基 稱本品30克，加1升蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌116℃20分鐘。 5.3.3膽鹽乳糖培養(yǎng)菌（BL） 稱本品36克，加1升蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌116℃20分鐘。 5.3.4曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB） 稱本品42克，加1升蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌116℃20分鐘。 5.3.5生理鹽水 稱取9 g 氯化鈉，加水1000 ml 溶解，分裝后于121℃±0.5℃濕熱滅菌30分鐘，供作稀釋劑用。 5.3.6 75%酒精棉 量取無水乙醇75ml，加水稀釋至100ml，搖勻，將脫脂棉與75%酒精混合即得。 5.3.7 0.1%新潔而滅 第3頁/共6頁 量取5%新潔而滅20ml，加水稀釋至約1000ml，搖勻，即得。 5.4進(jìn)入無菌室的操作要點(diǎn) 用肥皂水洗手，換消毒鞋，關(guān)閉緩沖間紫外燈，將用具物品搬入傳遞窗口內(nèi)，用紫外燈 滅菌15分鐘，關(guān)閉第一層門，用1%新潔而滅洗滌雙手，用消毒毛巾擦干，換上無菌衣、 褲、帽子、口罩及消毒鞋。關(guān)閉無菌室內(nèi)紫外燈，進(jìn)入第二層門并將用具搬至無菌室內(nèi) ，關(guān)閉無菌室門。 凡進(jìn)入無菌室后不應(yīng)再外出取物品，因此，在每次試驗(yàn)中所用物品必須計劃好，并準(zhǔn)備 好備用物品。從進(jìn)入第一層門直至無菌室內(nèi)，隨工作人員的進(jìn)入就噴霧0.1%新潔而滅溶 液。 5.5檢查法： 5.5.1 細(xì)菌、霉菌的染菌量，采用培養(yǎng)皿菌落計數(shù)法。 5.5.1.1 供試液的制備： 固體供試品以無菌操作稱取10g，置含0.9%氯化鈉的生理鹽水100ml中， 振搖溶解，使成1:10稀釋度的供試液。然后吸取1:10的供試液1ml，置含0.9% 氯化鈉的生理鹽水9ml中，稀釋成1:100稀釋度的供試液。依次可制成1:1000 的供試液。 5.5.1.2 吸樣： 分別吸取1:10、1:100、1:1000的供試液1ml分別注入2-3個平皿中。 5.5.1.3 注皿： 將事先融化并置45℃水浴中保溫備用的細(xì)菌、霉菌培養(yǎng)基分別傾注入平 皿，每皿約15ml，隨即轉(zhuǎn)動平面，使供試液與培養(yǎng)基混勻，分別作上標(biāo)記，置 水平臺上待凝。同時作空白對照（不加樣品，將兩個雙碟分別加入虎紅培養(yǎng)基 和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，操作同上）。 5.5.1.4 培養(yǎng)： 將凝固好的平皿按規(guī)定溫度倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)48小時；霉菌 培養(yǎng)72小時。 5.5.1.5菌落形態(tài) 細(xì)菌菌落是一個菌細(xì)胞或菌細(xì)胞團(tuán)在局限位置上，經(jīng)一定條件下繁殖成肉 眼可見的細(xì)菌群體，外觀濕潤或干燥，表面光滑或折皺，外緣整齊或缺陷。 具有放射或樹枝樣分枝的菌絲是霉菌菌落的特征。初形成時多無色透明， 有明顯的折光性，成熟的霉菌菌落有各種顏色的孢子形成。在較暗的背景下以 透射光觀察，易于識別。 5.5.1.6菌落計數(shù)法： 先用肉眼觀察，標(biāo)記并計數(shù)，然后用5-10倍放大鏡檢查有無遺漏。 第4頁/共6頁 如有片狀菌落或花斑樣菌落蔓延生長的以及平板受到污染的情況，則該平 板計數(shù)無效。若平板上有2個或者2個以上的菌落重疊，如可分辯，仍以2個 或是2個以上菌落計數(shù)。當(dāng)一個稀釋級用2個平板時，應(yīng)采用2個平板菌落數(shù) 的平均值。計算各稀釋級的平均菌落數(shù)按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。 如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于1時，則 報告菌數(shù)為小于10個。 菌數(shù)報告規(guī)則： 細(xì)菌宜選取平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋級，霉菌宜選取平均菌落數(shù)在30～100 之間的稀釋級作為報告菌數(shù)計算的依據(jù)。如有1個稀釋級在30～300（30～100）之間時， 將該稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如同時有2個稀釋級在30～300（30～100）之間 時，按下式計算兩級比值。 高稀釋級的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù) 比值 = ————————————————— 低稀釋級的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù) 當(dāng)比值≤2時，以兩稀釋級的均值報告，當(dāng)比值>2時，以低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋 倍數(shù)報告；如同時有3個稀釋級的平均菌落數(shù)均在30～300之間時，以后2個稀釋級計算級 間比值報告；如各稀釋級的平均菌落數(shù)均不在30～300以最接近30或300的稀釋級平均菌 落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如各稀釋級平均菌落數(shù)均在300（100）以上，按最高稀釋級平 均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如各稀釋級平均菌落數(shù)均小于30時，一般按最低稀釋級平 均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。 5.5.2 控制菌的檢查： 除另有規(guī)定外，取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或 處理后接種，經(jīng)增菌、分離培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭染色、生化試驗(yàn)與血清凝集試驗(yàn) 等項(xiàng)檢查。 5.5.2.1大腸桿菌檢查法： 取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其 中1份加入對照菌50-100個作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作 陰性對照。培養(yǎng)18-24小時（必要時可延至48小時）。陰性對照應(yīng)無菌生長。 取上述3份的培養(yǎng)物各0.2ml，分別接種至5mlMUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5 小時與24小時時，取未接種的MUG培養(yǎng)基管作本底對照，將各管置365nm紫外 光下觀察。陽性對照管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性。供試液的MUG管呈現(xiàn)熒光，MUG陽 性；無熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色 為陽性，呈試劑本色為陰性。 當(dāng)陰性對照呈陰性，陽性對照正常生長，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液澄 第5頁/共6頁 明，并證明無菌生長，判未檢出大腸桿菌。 如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，均應(yīng)取供試液膽鹽 乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng) 18-24小時，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平板無菌落生長，判未檢出大腸桿菌。 或有菌落生長，應(yīng)挑選2-3個可疑菌落按照藥典規(guī)定作生化試驗(yàn)及革蘭染色、 鏡檢，并按規(guī)定判斷結(jié)果。 5.5.2.2大腸桿菌菌落形態(tài) 在EBM瓊脂平板上的典型菌落呈紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊 緣整齊，表面光滑，帶有金屬光澤。 非典型形態(tài)，在EBM瓊脂平板上呈淺紫、粉紫、粉色，無明顯的暗色中心， 應(yīng)做為疑似菌進(jìn)行鑒定。 5.5.3對照試驗(yàn)： 5.5.3.1陰性對照試驗(yàn)：檢驗(yàn)試驗(yàn)全過程無菌技術(shù)的可靠性。 5.5.3.1.1 菌數(shù)測定陰性對照試驗(yàn) 分別吸取生理鹽水1ml置于無菌平皿中，分別按細(xì)菌、霉菌測定方法注皿、 培養(yǎng)，不得長菌。 5.5.3.1.2 控制菌檢查陰性對照試驗(yàn) 吸取生理鹽水于增菌液中，按控制菌檢查方法檢查不得長菌。 5.5.3.2 陽性對照試驗(yàn)：檢查供試品是否對控制菌生長產(chǎn)生干擾作用及檢查培養(yǎng)條件是否適 宜。 5.5.3.2.1 方法：于供試液中加入一定量的相應(yīng)對照菌，做平行試驗(yàn)。 5.5.3.2.2 規(guī)定陽性對照菌株為大腸桿菌[CMCC（B）44102]。對照菌的加入量為50- 100個，可事先預(yù)試確定。 5.5.3.2.3 用計數(shù)方法，取37℃培養(yǎng)18- 20小時的新鮮肉湯培養(yǎng)物，以10倍遞增稀釋至10-6,取其0.1ml于普通肉湯瓊脂板表 面涂抹進(jìn)行測定。 5.5.3.2.4 當(dāng)供試品未檢出菌時，而陽性對照試驗(yàn)也未能檢出，則不能做出供試品未檢出控制 菌的結(jié)論。 5.5.3.2.5 陽性對照試驗(yàn)操作必須與供試品檢驗(yàn)操作嚴(yán)格分開，避免交叉污染。 5.6復(fù)試： 5.6.1 菌數(shù)測定不合格者應(yīng)復(fù)試，控制菌檢驗(yàn)以一次檢驗(yàn)為準(zhǔn)，不再復(fù)試，但 應(yīng)保留檢出菌株一個月備查。 5.6.2 復(fù)試項(xiàng)目以不合格項(xiàng)目為準(zhǔn)，做單項(xiàng)復(fù)試。 5.6.3 復(fù)試需取同批樣品測定2次。 5.6.4 復(fù)試報告以3次測定結(jié)果的算術(shù)平均值報告。 第6頁/共6頁 5.7 檢驗(yàn)報告： 5.7.1 測定菌數(shù)報告：以各次測定結(jié)果的全部平均值報告。 5.7.2 控制菌以一次檢驗(yàn)的結(jié)果報告：報告為檢出或未檢出控制菌。 6 培訓(xùn) 6.1 培訓(xùn)對象：化驗(yàn)員。 6.2 培訓(xùn)時間：二小時。 7 記錄 記錄名稱 保存部門 保存時間 微生物限度檢驗(yàn)記錄 質(zhì)監(jiān)科 藥品有效期后一年 QF-01-006-00 微 生 物 限 度 檢 驗(yàn) 記 錄 品 名： 批 號： 規(guī) 格： 檢驗(yàn)日期： 年 月 日 細(xì)菌計數(shù) 30～35℃ 48h |稀釋倍數(shù) |空白 |1:10 |1:100 |1:1000| |結(jié) 果 |判定 | |平皿1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |個/g | | |平皿2 | | | | | | | | |平均菌落數(shù) | | | | | | | | 霉菌計數(shù) 25～28℃ 72h |稀釋倍數(shù) |空白 |1:10 |1:100 |1:1000| |結(jié) 果 |判定 | |平皿1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |個/g | | |平皿2 | | | | | | | | |平均菌落數(shù) | | | | | | | | 大腸桿菌 36±1℃ |供試液配制| |結(jié) 果 |判 定 | |增菌培養(yǎng) |培養(yǎng)基名稱| | | | | |培養(yǎng)時間 | | | | | |陽性對照 | | | | |陰性對照 | | | | | 供試液 | | | | |MUG培養(yǎng)管 |陽性管 | | | | | |樣品管 | | | | |加入靛基質(zhì)|陽性管 | | | | |試液 | | | | | ...
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