微生物常規(guī)鑒定技術(shù)
微生物常規(guī)鑒定技術(shù) 一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察 １、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、 細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進行觀察，直觀 地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微 生物的目的。 ２、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種 培養(yǎng)基中生長繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細(xì)菌在一定條件下，培 養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。，以此可以對不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此，微生物培養(yǎng)特 性的觀察也是微生物檢驗鑒別中的一項重要內(nèi)容。 　?。保┘?xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色 （色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性 等。在液體培養(yǎng)中的表面生長情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接 種觀察運動、擴散情況?！?２）霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落 和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長、沉淀 或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無 限伸長沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因 而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色 ，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。 [pic] 革蘭氏染色: 革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì) 菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別 染色法。 該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G—菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所 決定的。G—菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度 低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和 碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽 聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通 透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時的顏色 步驟： （1）涂片：涂片方法與簡單染色涂片相同。 （2）晾干：與簡單染色法相同。 （3）固定，與簡單染色法相同 （4）結(jié)晶紫色染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶 紫染色液染色1分鐘。 （5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。 （6）媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色20—25s至流出液無色，立即水洗。 （9）復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染5min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液。 （11）晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。 （12）鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色 反應(yīng)性。 （13）實驗完畢后的處理： ①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用 擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2—3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2—3次。注意擦 鏡頭時向一個方向擦拭。 ②看后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干 [pic] Aseptic technique: Streak plate: [pic] 二、生理生化試驗 　　微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來鑒別一 些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重 要依據(jù)之一。 微生物檢驗中常用的生化反應(yīng)有： 1、尿素酶（Urease）試驗 　　有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅 呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因為不論底物尿素是否存在，細(xì)菌均能合成此酶。其活 性最適pH為7.0。 　　試驗方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖均，于36±1℃培 養(yǎng)10，60和120min，分別觀察結(jié)果?；蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，留 底部作變色對照。培養(yǎng)2，4和24h分別觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定 ，變?yōu)榉奂t色為陽性。 2、氧化酶（Oxidase）試驗 　　氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì) 胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。 試驗方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴，陽性者Kovacs 氏試劑呈粉紅色~深紫色，Ewing氏改進試劑呈藍(lán)色。陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi) 判定試驗結(jié)果。 注意事項： 1. 鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液容易氧化，溶液應(yīng)裝在棕色瓶中，并在冰箱內(nèi)保 存，如溶液變?yōu)榧t褐色，即不宜使用。 2. 鐵、鎳鉻絲等金屬可催化二甲基對苯撐二胺呈紅色反應(yīng)，若用它來挑取菌苔 ，會出現(xiàn)假陽性，故必須用白金絲或玻璃棒（或牙簽）來挑取菌苔。 3. 在濾紙上滴加試劑，以剛剛打濕濾紙為宜，如濾紙過濕，會防礙空氣與菌苔 接觸，從而延長了反應(yīng)時間，造成假陰性。 3、過氧化氫酶的測定 過氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過氧化氫分解水和氧。 1. 試劑：3－10％過氧化氫（H2O2） 2. 菌種培養(yǎng)：將測試菌種接種于合適的培養(yǎng)基斜面上，適溫培養(yǎng)18－24h。 3. 試驗方法：取一干凈的載波片，在上面滴1滴3－10％的H2O2，挑取1環(huán)培養(yǎng)18－24 h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)，則為過氧化氫酶陽性，無 氣泡者為陰性。也可將過氧化氫溶液直接加入斜面上，觀察氣泡的產(chǎn)生。 4. 注意事項：過氧化氫酶是1種以正鐵血紅素作為輔基的酶，所以測試菌所生長的培養(yǎng) 基不可含有血紅素或紅血球。 4、甲基紅（Methyl Red）試驗 　　腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中 ，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培 養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。 　　試驗方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于MR－VP生化鑒定管，于36通用培養(yǎng) 基，培養(yǎng)于36±1°C或30°C（以30°C較好）3~5天，從第二天起，每日取培養(yǎng)液1ml，加甲 基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第 5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。 　　甲基紅為酸性指示劑，pH范圍為4.4~6.0，其pK值為5.0。故在pH5.0以下，隨酸度而 增強黃色，在pH5.0以上，則隨堿度而增強黃色，在pH5.0或上下接近時，可能變色不夠 明顯，此時應(yīng)延長培養(yǎng)時間，重復(fù)試驗。 5、V-P試驗 　　某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧 成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的 胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應(yīng)。 　　試驗方法： 　?。保㎡’Meara氏法：將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液1ml加O ’Meara試劑（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml， 搖動試管1~2min，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦 有主張在48~50°C水浴放置2h后判定結(jié)果者。 　?。玻〣arritt氏法：將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)4天、培養(yǎng)液2.5ml先 加入5°Cα萘酚（2-na- phthol）純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動2~5min，陽性菌常立即 呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定 為陰性。 　?。常┛焖俜ǎ簩?.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培 養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%α- 萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動后放置5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使 用。 本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時， 通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。 6、含碳化合物的利用 細(xì)菌能否利用某些含碳化合物作為唯一碳源，反映該菌是否產(chǎn)生代謝這種化合物的有 關(guān)酶系，因而作為鑒定依據(jù)。測定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方很多，因種而異?，F(xiàn)介紹1種合成的 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有些細(xì)菌還可適當(dāng)補加各種維生素。培養(yǎng)基可制成液體，分裝試管，也可 制成固體平板?？捎糜跍y定的底物種類很多，有單糖、雙糖、糖醇、脂肪酸、羥基酸及 其他有機酸、醇、各種氨基酸類胺類以及碳?xì)浠衔锏取Ｌ堑暮恳话銥?％，醇類酚類 等的含量一般為0.1－0.2％，氨基酸的含量一般為0.5％。因碳?xì)浠衔锊蝗苡谒稍?液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，或加入到45℃的固體培養(yǎng)基中，振蕩后立即倒成平板。有些底物 不宜用高壓滅菌，可用過濾法滅菌后加入已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，某些醇類和酚類不必 滅菌。 接種和觀察結(jié)果：菌種最好做成懸液，避免帶入少量碳源干擾試驗結(jié)果。平板培養(yǎng)用 接種環(huán)點種，液體培養(yǎng)則用直針接種。每一測定菌必須接種未加碳水化合物的空白基礎(chǔ) 培養(yǎng)基作對照。 適溫培養(yǎng)2、5、7天后觀察，凡測定菌在有碳水化合物的培養(yǎng)基中生長情況，明顯超 過空白培養(yǎng)基的生長量為陽性，否則為陰性。假若兩種培養(yǎng)基上生長情況差別不明顯， 開在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種3次，如差別仍不明顯則以陰性論。 7、葡萄糖的氧化發(fā)酵試驗 在細(xì)菌鑒定中，糖類發(fā)酵產(chǎn)酸是1項重要依據(jù)。細(xì)菌對糖類的利用有2種類型：1種是 從糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，不需要以分子氧作為最終受氫體，稱發(fā)酵型產(chǎn)酸；另一種則以分子氧 作為最終受氫體，稱氧化型產(chǎn)酸。前者包括的菌種類型為多數(shù)。氧化型產(chǎn)酸量較少，所 產(chǎn)生的酸常常被培養(yǎng)基中的蛋白胨分解時所產(chǎn)生的胺所中和，而不表現(xiàn)產(chǎn)酸。為此，Hu gh和Leifson提出一種含有低有機氮的培養(yǎng)基，用以鑒定細(xì)菌從糖類產(chǎn)酸是屬氧化型產(chǎn)酸 或發(fā)酵型產(chǎn)酸。這一試驗廣泛用于細(xì)菌鑒定。一般用葡萄糖作為糖類代表。也可利用這 一基礎(chǔ)培養(yǎng)基來測定細(xì)菌從其他糖類或醇類產(chǎn)酸的能力。 （1）接種 ：以18－24h的幼齡菌種，穿刺接種在上述培養(yǎng)基中，每株菌接4管，其中2管用油封 蓋（凡士林：液體石蠟＝1：1混合后滅菌），約加0.5－1厘米厚，以隔絕空氣為閉 管。另2管不封油為開管，同時還要有不接種的閉管作對照。適溫培養(yǎng)1、2、4、7天 觀察結(jié)果。 （2）結(jié)果觀察：氧化型產(chǎn)酸――僅開管產(chǎn)酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部產(chǎn)堿（ 1－2d），后來才稍變酸。發(fā)酵型產(chǎn)酸則開管及閉管均產(chǎn)酸，如產(chǎn)氣，則在瓊脂柱內(nèi) 產(chǎn)生氣泡。 8、糖或醇類發(fā)酵試驗 　　不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或 產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。 　　試驗方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基 管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36±1.0°C培養(yǎng)，每天觀察 結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性 ，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種 菌有無動力，若有動力、培養(yǎng)物可呈彌散生長。 本試驗主要是檢查細(xì)菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進行各種細(xì)菌的鑒別 ，因而每次試驗，常需同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍(lán) 和An-drade指示劑。 注：對于糖醇類發(fā)酵現(xiàn)在一般用糖、醇類細(xì)菌微量生化鑒定管在36℃18－24h即可出結(jié) 果。 9、硝酸鹽（Nitrate）還原試驗 　　有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝 酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。 　　試驗方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）試液各 0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或 于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。 　　用α- 萘胺進行試驗時，陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進行試驗時必須有未 接種的培養(yǎng)基管作為陰性對照。α-萘胺具有致癌性、故使用時應(yīng)加注意。 10、靛基質(zhì)（Imdole）試驗 　　某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來 。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。 　　試驗方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗培養(yǎng)基管，于36±1C培養(yǎng)24h時后，取約 2ml培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑2~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量乙醚或二 甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Ko vacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色...
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