檢驗(yàn)員培訓(xùn)教程系列3
第三部分 儀器分析法 第一章 紫外分光光度法 一、原理 可見(jiàn)光、紫外線照射某些物質(zhì)，主要是由于物質(zhì)分子中價(jià)電子能級(jí)躍遷對(duì)輻射的吸收， 而產(chǎn)生化合物的可見(jiàn)紫外吸收光譜?；谖镔|(zhì)對(duì)光的選擇性吸收的特性而建立分光光度 法或稱吸收光譜法的分析方法。它是以朗伯──比耳定律為基礎(chǔ)。 1 朗伯—比耳定律 A = lg—- = ECL T 式中 A為吸收度； T為透光率； E為吸收系數(shù)，采用的表示方法是（E），其物理意義為當(dāng)溶液濃度為1%（g/ml），液層 厚度為1cm時(shí)的吸收度數(shù)值； C為100ml溶液中所含被測(cè)物質(zhì)的重量（按干燥品或無(wú)水物計(jì)算），g； L為液層厚度，cm。 二、使用范圍 凡具有芳香環(huán)或共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，根據(jù)在特定吸收波長(zhǎng)處所測(cè)得的吸收度， 可用于藥品的鑒別、純度檢查及含量測(cè)定。 三、儀器 可見(jiàn)- 紫外分光光度計(jì)。其應(yīng)用波長(zhǎng)范圍為200～400nm的紫外光區(qū)、400～850nm的可見(jiàn)光區(qū)。 主要由輻射源（光源）、色散系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、吸收池、數(shù)據(jù)處理機(jī)、自動(dòng)記錄器及顯 示器等部件組成。 本儀器是根據(jù)相對(duì)測(cè)量的原理工作的，即先選定某一溶劑（或空氣、試樣）作為標(biāo)準(zhǔn) （空白或稱參比）溶液，并認(rèn)為它的透光率為100％（或吸收度為0），而被測(cè)的試樣透 光率（或吸收度）是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)溶液而言，實(shí)際上就是由出射狹縫射出的單色光，分別 通過(guò)被測(cè)試樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液，這兩個(gè)光能量之比值，就是在一定波長(zhǎng)下對(duì)于被測(cè)試樣的透 光率（或吸收度）。 本儀器可精密測(cè)定具有芳香環(huán)或共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物、有色物質(zhì)或在適當(dāng)條件 下能與某些試劑作用生成有色物的物質(zhì)。 使用前應(yīng)校正測(cè)定波長(zhǎng)并按儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。 四、儀器的校正 1.波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 以儀器顯示的波長(zhǎng)數(shù)值與單色光的實(shí)際波長(zhǎng)值之間誤差表示，應(yīng)在±1.0nm范圍內(nèi)。 可用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進(jìn)行校正。 2.吸收度的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 3.雜散光的試驗(yàn) 4.波長(zhǎng)重現(xiàn)性試驗(yàn) 5.分辨率試驗(yàn) 五、測(cè)定方法 1.對(duì)照品比較法 （1）按各品種項(xiàng)下的方法，分別配制供試品溶液和對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液中所含被測(cè) 成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測(cè)成分標(biāo)示量的100±10%，所用溶劑也應(yīng)完全一致，在規(guī)定 的波長(zhǎng)測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的吸收度后，按下式計(jì)算含量，即得。 （2）計(jì)算式 A樣×G對(duì)/稀釋倍數(shù)×100×1 含量（%）= ————————————-- ×100% A對(duì)×G樣/稀釋倍數(shù)×100×1 2.吸收系數(shù)法 （1）按各品種項(xiàng)下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度，再以該品種 在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計(jì)算含量。用本法測(cè)定時(shí)，應(yīng)注意儀器的校正和檢定。 （2）計(jì)算式 A樣 含量（%）= ——————————————- ×100% G樣/稀釋倍數(shù)×(E)對(duì)×100×1 3.計(jì)算分光光度法 采用計(jì)算分光光度法應(yīng)慎重。本法有多種，使用時(shí)均應(yīng)按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行。 當(dāng)吸收度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測(cè)定時(shí)，波長(zhǎng)的微小變化可能對(duì)測(cè)定結(jié) 果造成顯著影響，故對(duì)照品和供試品測(cè)試條件應(yīng)盡可能一致。若測(cè)定時(shí)不用對(duì)照品，如 維生素A測(cè)定法，則應(yīng)在測(cè)定時(shí)對(duì)儀器作仔細(xì)的校正和檢定。 六、注意事項(xiàng) 1.空白溶液與供試品溶液必須澄清，不得有渾濁。如有渾濁，應(yīng)預(yù)先過(guò)濾，并棄去初濾 液。 2.測(cè)定時(shí)，除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同瓶溶劑為空白對(duì)照，采用1cm的石英 吸收池。 3.在規(guī)定的吸收峰波長(zhǎng)±2nm以內(nèi)測(cè)試幾個(gè)點(diǎn)的吸收度，以核對(duì)供試品的吸收峰波長(zhǎng)位置 是否正確，除另有規(guī)定外，吸收峰波長(zhǎng)應(yīng)在該品種項(xiàng)下規(guī)定的波長(zhǎng)±2nm以內(nèi)；否則應(yīng)考 慮該試樣的真?zhèn)巍⒓兌纫约皟x器波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度，并以吸收度最大的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。 4.一般供試品溶液的吸收度讀數(shù)，以在0.3～0.7之間的誤差較小。 5.吸收池應(yīng)選擇配對(duì)，否則要引入測(cè)定誤差。在規(guī)定波長(zhǎng)下兩個(gè)吸收池的透光率相差小 于0.5％的吸收池作配對(duì)，在必要的情況時(shí)，須在最終測(cè)量扣除吸收池間的誤差修正值。 6.由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測(cè)定供試品的吸收度后應(yīng)減去空白讀數(shù) ，再計(jì)算含量。 7.儀器的接地必須良好，一切裸露的零件對(duì)地電位不得超過(guò)24伏（測(cè)電筆的氖管不得發(fā) 亮）。 8.在使用過(guò)程中，如需開(kāi)啟試樣室蓋時(shí)或暫時(shí)停止測(cè)試時(shí)，必須及時(shí)推入光門(mén)鈕桿（使 光電管前光門(mén)關(guān)閉），保護(hù)光電管，以防止光電管受強(qiáng)光或長(zhǎng)時(shí)間照射而損壞。 9.在測(cè)定時(shí)或改測(cè)其它檢品時(shí)，應(yīng)用待測(cè)溶液沖洗吸收池3～4次，用干凈綢布或擦鏡紙 擦凈吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨損）。 10.取吸收池時(shí)，應(yīng)拿毛玻璃兩面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及時(shí) 用測(cè)定溶劑沖凈，再用純化水沖凈，用干凈綢布或擦鏡紙擦干，晾干后，放入吸收池盒 中，防塵保存。 11.若吸收池內(nèi)外壁沾污，兩池差較大的處理。 （1）可用綢布纏在扁竹條外或用脫脂棉纏在細(xì)玻璃棒上蘸上乙醇，輕輕摩擦，再用純化 水沖凈。 （2）如上述方法處理不好，必要時(shí)可用重鉻酸鉀- 硫酸洗液泡洗1～2分鐘，用自來(lái)水沖凈，再用純化水沖凈。 （3）不得用毛刷刷洗或硬物拭擦，以防止表面光潔度受損影響正常使用。 12.請(qǐng)務(wù)必注意經(jīng)常保持硅膠的干燥，目的是保護(hù)光學(xué)元件和光電放大器系統(tǒng)不致受潮損 壞而影響儀器的正常工作，如發(fā)現(xiàn)有的硅膠由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色，應(yīng)立即更換。該儀器干 燥劑筒有兩個(gè)：一個(gè)是裝在放大器暗盒上，另一個(gè)裝在單色光器暗盒上。 13.在更換硅膠干燥劑時(shí)，應(yīng)關(guān)閉切斷電源。 14.在停止工作期間，主機(jī)試樣室內(nèi)應(yīng)放入袋裝或筒裝硅膠干燥劑。用防塵罩罩住整個(gè)儀 器，并在防塵罩內(nèi)放數(shù)袋防潮硅膠。 15.儀器在操作中，狹縫的寬度應(yīng)從小逐漸開(kāi)大。若狹縫過(guò)大，由于進(jìn)入光電管的光能量 強(qiáng)度過(guò)大，將會(huì)使放大器輸出信號(hào)達(dá)到飽和，以至數(shù)字顯示出溢出（即數(shù)字閃爍或示1不 變）。這不是儀器有故障。 16.將波長(zhǎng)旋轉(zhuǎn)放在625nm，鋏縫關(guān)閉在0.02nm附近，選擇按鍵恢復(fù)在停止工作部位（即 三個(gè)鍵均彈出）。 17.搬動(dòng)儀器時(shí)應(yīng)搬在主體端，不要搬在試樣室和光電管盒端以及光源燈室部位，以防止 儀器狹縫或光路部件受力而發(fā)生變形。并在搬動(dòng)或運(yùn)輸時(shí)，應(yīng)將可動(dòng)部分固定，如各旋 鈕可用膠布貼住，狹縫位置開(kāi)大些，然后固定，不要關(guān)小狹縫，以免運(yùn)輸時(shí)振動(dòng)使狹縫 刀口受損壞。 18.儀器的光柵、反射鏡絕對(duì)不能擦拭，否則將損壞儀器光學(xué)表面，增加雜散光。 19.儀器經(jīng)過(guò)搬動(dòng)請(qǐng)及時(shí)檢查并糾正波長(zhǎng)精度，為保證測(cè)定的準(zhǔn)確性請(qǐng)經(jīng)常校準(zhǔn)波長(zhǎng)精度 。如有異常，應(yīng)立即報(bào)告質(zhì)量保證部，但不得擅自調(diào)整，并及時(shí)做好記錄。 七、結(jié)果計(jì)算 A E（供試品） = —— CL E（供試品） 含量（%）= ——————————- ×100% E（標(biāo)準(zhǔn)值或?qū)φ掌罚?八、允許差 儀器分析方法的誤差限度，除另有規(guī)定外，其相對(duì)偏差應(yīng)在±(2.0～3.0)%。 第二章 比色法 一、原理及適用范圍 在可見(jiàn)光區(qū)，除某些物質(zhì)有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒(méi)有吸收，但可在一定條件下加入 顯色試劑或經(jīng)過(guò)處理使其顯色后，根據(jù)顏色深淺與濃度成正比關(guān)系，則可用比色法測(cè)定 含量。 二、儀器 可見(jiàn)分光光度計(jì)（或比色計(jì)）其應(yīng)用波長(zhǎng)范圍為400～850nm的可見(jiàn)光區(qū)。主要由輻射源 （光源）、色散系統(tǒng)（或?yàn)V光片）、檢測(cè)器系統(tǒng)、顯示系統(tǒng)、記錄器及吸收池等部件組 成。使用前應(yīng)校正測(cè)定波長(zhǎng)并按儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。 三、儀器的校正 按照紫外分光光度法項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定及按儀器說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行校正。波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度應(yīng)在 ±3nm范圍內(nèi)。 四、測(cè)定方法 1.用比色法測(cè)定時(shí)，應(yīng)取對(duì)照品同時(shí)操作。除另有規(guī)定外，比色法所用的空白系指用同 體積的溶劑代替對(duì)照品或供試品溶液，然后依次加入等量的相應(yīng)試劑，并用同樣方法處 理。在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定對(duì)照品和供試品溶液的吸收度后，按紫外分光光度法項(xiàng)下“對(duì)照 品比較法”的計(jì)算式計(jì)算含量。 2.當(dāng)吸收度和濃度關(guān)系不呈線性時(shí)，應(yīng)取數(shù)份梯度量的對(duì)照品溶液，用溶劑補(bǔ)充至同一 體積，顯色后測(cè)定各份溶液的吸收度，然后以吸收度與相應(yīng)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根 據(jù)供試品的吸收度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出其含量。 三、注意事項(xiàng) 測(cè)定時(shí)，應(yīng)取對(duì)照品平行操作，使所用試劑用量、反應(yīng)溫度、酸堿度、反應(yīng)時(shí)間等完全 一致，對(duì)隨時(shí)間變化影響顯色的品種應(yīng)準(zhǔn)確控制讀數(shù)時(shí)間，操作時(shí)應(yīng)注意避光。 第三章 高效液相色譜法 一、原理 高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩 沖液等流動(dòng)相，壓入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)， 在柱內(nèi)各成分被分離后，依次進(jìn)入檢測(cè)器，色譜信號(hào)由記錄儀或積分儀記錄。 二、適用范圍 高效液相色譜法是一種分離分析方法，適用于揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大的高分 子化合物以及離子型化合物等的定性、定量分析。中國(guó)藥典主要用于藥品的含量測(cè)定、 有關(guān)物質(zhì)檢查、雜質(zhì)限度檢查和鑒別等。 三、儀器 高效液相色譜儀主要由輸液泵系統(tǒng)、進(jìn)樣器系統(tǒng)、色譜柱、檢測(cè)器、記錄器、顯示器及 數(shù)據(jù)處理機(jī)（或兼有組分收集系統(tǒng)）等組成。使用時(shí)應(yīng)按儀器的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。 四、儀器的校正 1.高效液相色譜儀的柱箱控溫精度、基線噪聲、基線漂移、靈敏度或檢測(cè)限、線性范圍 的檢定均按儀器說(shuō)明書(shū)的技術(shù)要求進(jìn)行校驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。 2.以紫外- 可見(jiàn)光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、差示折光檢測(cè)器為檢測(cè)器的實(shí)驗(yàn)室通用液相色譜儀的檢定 ，所用各種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)使用經(jīng)國(guó)家技術(shù)監(jiān)督部門(mén)批準(zhǔn)頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。具體校正方法和 主要技術(shù)指標(biāo)見(jiàn)“高效液相色譜儀檢測(cè)器的校驗(yàn)”。 3.泵的耐壓試驗(yàn) 4.泵流量設(shè)定值誤差、流量穩(wěn)定性誤差的試驗(yàn) 5.柱恒溫箱溫度設(shè)定值誤差和控溫穩(wěn)定性誤差的試驗(yàn) 6.梯度準(zhǔn)確度的試驗(yàn) 7.定性定量重現(xiàn)性的試驗(yàn) 五、對(duì)儀器的一般要求 1.色譜柱的填充劑和流動(dòng)相的組分應(yīng)按各品種項(xiàng)下的規(guī)定。常用的色譜柱填充劑有硅膠 （正相色譜）和化學(xué)鍵合硅膠，后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠（反相色譜）最為常用， 辛基硅烷鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。離子交換填充劑用于離子交換 色譜；凝膠或玻璃微球等填充劑用于分子排阻色譜等。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢 測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器。 2.藥典正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類(lèi)、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類(lèi)型不得任意 改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相 各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種并 達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。 3.一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。 六、系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按各品種項(xiàng)下要求對(duì)儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整， 應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求，或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾 因子。 1.色譜柱的理論板數(shù)（n） n = 5.54(tR/Wh/2)2 式中 tR為保留時(shí)間（以分鐘或長(zhǎng)度計(jì)，下同，但應(yīng)取相同單位）； Wh/2為半峰高寬。 2.分離度（R） 除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。 2(tR2－tR1) R = ————- W1＋W2 式中 tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間； tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 3.重復(fù)性 取各品種項(xiàng)下的對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏 差應(yīng)不大于2.0%。也可按各品種校正因子測(cè)定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對(duì)照 品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣3次，計(jì)算平均校 正因子，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也應(yīng)不大于2.0%。 4.拖尾因子（T） 除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95～1.05之間。 W0.05h T = ——- 2d1 式中 W0.05h為0.05峰高處的峰寬； d1為峰極大至峰前沿之間的距離。 七、測(cè)定法 定量測(cè)定時(shí)，可根據(jù)供試品的具體情況采用峰面積法或峰高法。測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，須采 用峰面積法。 （一）內(nèi)標(biāo)法 加校正因子測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量 1.按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取 各溶液，配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液。取一定量注入液相色譜儀，記錄色譜圖。測(cè) 量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子： AS/CS 校正因子（f）= ——- AR/CR 式中 AS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高； AR為對(duì)照品的峰面積或峰高； CS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度； CR為對(duì)照品的濃度。 再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)量供試 品中待測(cè)成分（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量： AX 含量（CX）= f·——- AS/CS CX×稀釋倍數(shù) 含量（%）= ———————— ×100% GX×(1－干燥失重) 式中 AX為供試品（或其雜質(zhì)）的峰面積或峰高； CX為供試品（或其雜質(zhì)）的濃度； GX為供試品的稱樣量。 當(dāng)配制校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液...
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